Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 实验计划 1

多克隆疟原虫株系中特定单倍型药物反应表型的剖析：

1. 实验质料和试剂准备

- 选择3个疑似多克隆的P. falciparum株系，，，，，例如：IPC_3445 (MRA-1236), IPC_5202 (MRA-1240), IPC_6403 (MRA-1285)。。
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- 准备O+型人类红细胞和RPMI 1640作育基，，，，，以及所需的增补剂和抗生素。。
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- 准备氯喹、甲氟喹和哌拉喹药物储备溶液。。
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- 准备用于DNA提取、基因分型和PCR反应的相关试剂。。
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2. 疟原虫株系的体外作育

- 使用标准体外作育条件，，，，，将疟原虫株系在37°C、5% CO2和90% N2气氛下作育。。
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3. 多克隆性子简直认

- 提取每个疟原虫株系的DNA，，，，，并在24个高度多态性SNP位点举行基因分型。。
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4. 简单寄生虫谱系的疏散

- 通过限制稀释法，，，，，将疟原虫株系在96孔板中举行稀释，，，，，以疏散单个受熏染的红细胞。。
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- 使用SYBR? Green I荧光染料检测寄生虫DNA，，，，，确定阳性孔。。
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5. 基因分型和系统发育剖析

- 对每个阳性孔中的寄生虫举行基因分型，，，，，使用24-SNP分子条形码法。。
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- 构建系统发育树，，，，，剖析差别寄生虫谱系之间的关系。。
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6. 体外抗疟药敏感性测试

- 使用SYBR? Green Antimalarial Assay对氯喹、甲氟喹和哌拉喹的敏感性举行测试。。
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- 测定每种药物的半最大抑制浓度（IC50）。。
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7. 寄生虫存活试验

- 关于CQ和PPQ，，，，，使用环阶段存活试验(RSA)和哌拉喹存活试验(PSA)来确定寄生虫对药物的存活率。。
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8. 抗疟药抗性位点的测序和基因分型

8.1 目的基因的选择

选择已知与抗疟药抗性相关的基因，，，，，包括但不限于：

- 氯喹抗性相关基因：pfcrt（疟原虫氯喹抗性转运卵白）

- 甲氟喹和哌拉喹抗性相关基因：pfmdr-1（疟原虫多药耐药1基因）

- 蒿甲醚抗性相关基因：K13基因

8.2 DNA提取和PCR扩增

- 使用DNA提取试剂盒从疟原虫作育物中提取基因组DNA。。
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- 设计特异性引物，，，，，针对上述基因举行PCR扩增。。
。。例如，，，，，使用五组引物笼罩整个pfcrt基因。。
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8.3 SNPs检测

- 使用Sanger测序手艺对PCR产品举行测序，，，，，以检测pfcrt、pfmdr-1和K13基因中的单核苷酸多态性（SNPs）。。
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- 使用测序效果剖析软件（如DNASTAR Lasergene）举行序列数据的剖析和可视化。。
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8.4 拷贝数变异检测

- 使用ΔΔCT要领确定pfmdr-1和pfmp-2（疟原虫血浆膜卵白2基因）的拷贝数，，，，，这些基因与甲氟喹和哌拉喹抗性相关。。
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- 通过实时定量PCR（qPCR）手艺，，，，，在统一孔中同时扩增目的基因和内参基因（如β-微管卵白基因或丝氨酸tRNA毗连酶基因）。。
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8.5 qPCR实验操作

- 准备主混淆液，，，，，包括Multiplex Probe qPCR Mix Plus U （GDSBio, P2701）、无菌水、目的基因和内参基因的预配方Taqman SNP检测。。
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- 将主混淆液分派到96孔PCR板中，，，，，每个样本包括75 ng的寄生虫DNA。。
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- 使用CFX96实时PCR仪器举行样品扩增，，，，，并使用基因表达模？？？槠饰鲂Ч。。
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8.6 数据剖析

- 将目的基因的拷贝数与内参基因的拷贝数举行较量，，，，，以确定相对拷贝数。。
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- 使用已知拷贝数的标准样品（如3D7株系）举行校准。。
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- 关于pfmdr-1和pfmp-2基因，，，，，剖析是否保存基因扩增征象，，，，，这可能与抗药性生长有关。。
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8.7 效果纪录息争释

- 纪录所有测序和qPCR效果，，，，，包括基因型和拷贝数。。
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- 诠释测序和拷贝数变异数据，，，，，剖析它们与体外抗药性表型之间的潜在联系。。
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8.8 质量控制

- 包括使用已知基因型的实验室控制株系作为阳性和阴性比照。。
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- 对每个实验办法举行重复，，，，，以确保数据的准确性和可重复性。。
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以上办法提供了详细的实验流程，，，，，用于检测和剖析与抗疟药抗性相关的基因变异。。
。。实验操作应严酷遵守实验室规程和生物清静指南，，，，，确保数据的准确性和可靠性。。
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9. 数据剖析

- 使用GraphPad Prism软件剖析IC50值和存活率数据。。
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- 应用统计要领较量差别寄生虫谱系之间的差别。。
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10. 效果诠释和报告

- 诠释实验效果，，，，，讨论差别寄生虫谱系的抗药性表型。。
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- 撰写实验报告，，，，，包括实验要领、效果和讨论。。
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11. 清静性和质量控制

- 确保实验操作切合生物清静标准。。
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- 使用已知的实验室控制株系作为阳性和阴性比照。。
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12. 实验质料的生涯和纪录

- 纪录所有实验办法和效果。。
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- 生涯所有原始数据和实验质料，，，，，以备后续剖析和验证。。
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这个实验计划提供了一个周全的框架，，，，，用于研究P. falciparum株系的多克隆性和抗药性表型。。
。。实验操作应严酷遵守实验室规程和生物清静指南。。
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Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 

货号：P2701，，，，，P2702，，，，，P2703，，，，，P2704 

产品简介 

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U 是用于探针法实时定量 PCR 的 2×浓缩预混液，，，，，使用时 只需加入模板、引物和探针即可举行反应。。
。。本品含有抗体手艺修饰的热启动酶 Hotstart Taq DNA 聚合酶，，，，，配合威尼斯国际2299cc特制的 Real Time PCR Buffer，，，，，不但有用抑制引物二聚体和其他非 特异性扩增，，，，，并且能够提高扩增效率，，，，，可以举行多重探针 qPCR 反应。。
。。该试剂引入 了 dUTP/UDG 防污染系统，，，，，可以在 PCR 反应前扫除含 dUTP 的 PCR 产品，，，，，有用阻止因 扩增产品的交织污染对定量的影响。。
。。本品利便用于制备 IVD 分子诊断试剂盒，，，，，对靶基因定 量准确、可信度高，，，，，重复性好。。
。。本品可搭配 TaqMan 等种种荧光探针使用，，，，，与常见定量 PCR 仪完善兼容，，，，，如 ABI、Roche、Bio-Rad 等。。
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产品用途

探针法基因表达剖析

多重低拷贝基因检测

产品特点

可举行多重探针法荧光定量PCR

适合常见定量机型

高效热启下手艺带来高特异和可重复的扩增

含 dUTP/UDG 防污染系统

稳固性高，，，，，适合大规模检测