1 克隆PCR产品的最优条件是什么？？？？
？ 
最佳插入片断：载体比需实验确定。。1：1（插入片断：载体）常为最佳比，，摩尔数比1：8或8：1也行。。应测定比值规模。。毗连用5ul 2X毗连液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4毗连酶，，插入片断共10ul。。室温保温1小时，，或4℃住宿。。在这2种温度下，，缺T-凸出端的载体会自连，，爆发蓝斑。。室温保温1小时能知足大大都克隆要求，，为提高毗连效率，，需4℃住宿。。 

2  PCR产品是否需要用凝胶纯化？？？？
？ 
如凝胶剖析扩增产品只有一条带，，不需要用凝胶纯化。。如可见其他杂带，，可能是积累了大宗引物的二聚体。。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，，这会爆发高比例的带有引物二聚体的克隆，，而非目的插入片断。。为此需在克隆前做凝胶纯化。。 

3  若是没有接纳到目的片断，，还需要作什么比照实验？？？？
？ 
A）涂布未转化的感受态细胞。。 
若有菌落，，批注氨苄失效，，或污染上带有氨苄抗型的质粒，，或爆发氨苄抗型的菌落。。 
B）转化完整质粒，，盘算菌落生长数，，测定转化效率。。 
例如，，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。。用SOC稀释到1000ul后，，用100ul铺板。。作育住宿，，爆发1000个菌落。。转化率为： 爆发菌落的总数/铺板DNA的总量。。 
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。。详细而言转化用10ng DNA，，用SOC稀释到1000u后含10 ngDNA，，用1/10铺板，，共用1 ng DNA。。转化率为： 
1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 
转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞 
如没有菌落或少有菌落，，感受态细胞的转化率太低。。 
C）如用pGEM-T正比照，，或PCR产品，，爆发>20-40蓝斑（用指定办法10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），，批注载体失去T。？？？？
？赡苁桥连酶污染了核酸酶。。T4 DNA毗连酶（M1801，，M1804，，M1794）质量标准好无核酸酶污染，，不应用其它泉源的T4 DNA毗连酶替换。。 
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，，毗连pGEM-T正比照，，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,凭证指定的实验办法，，可得100个菌落，，其中60%应为白斑，，如爆发>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，，毗连有问题。。

4  比照实验效果好，，却没有接纳到目的片断，，实验出了什么问题？？？？
？ 
A）毗连用室温保温1小时，，能知足大大都克隆。，为提高效率，，需4℃住宿。。 
B）插入片断带有污染，，使3`-T缺失，，或抑制毗连，，抑制转化。。为此，，将插入片断和pGEM-T正比照混淆，，再毗连。。如降低了比照的菌落数，，插入片断需纯化，，或重新制备。。如爆发大宗的蓝斑，，插入片断污染有核酸酶，，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。。 
C）插入片断不适于毗连。。用凝胶纯化的插入片断，，因受UV太过照射，，时有爆发。。UV太过照射会爆发嘧啶二聚体，，倒运于毗连，，DNA必需重新纯化。。 
D）带有修复功效的耐热DNA聚合酶的扩增产品最后无A，，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在最后加A。。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体手艺资料（TM042）。。 
E）高度重复序列可能会不稳固，，在扩增中爆发缺失和重排，，如发明插入片断高频率地爆发缺失和重排，，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，，如SURE细胞