要先对PCR目的序列的长度有个大致预计：

第一步：找到Primer3的站点。。。。。你不必记着这个站点，，可是要记着“Primer3”这个词，，然后翻开GOOGLE首页，，输入Primer3，，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”

网址是http://frodo.wi.mit.edu/。。。。。

第二步：贴上模板序列。。。。。进入Primer3站点，，可以看到一个引物设计的界面。。。。。在“Paste source sequence below (5'->3'…..”下面的大空框内里把你的模板序列粘帖进去。。。。。注重是5'->3'偏向的，，数字或者空格都没关系，，软件会自动过滤的。。。。。

第三步：主要参数设定。。。。。首先是“Product Size Ranges”，，若是你不希望软件给你随便做的话，，首先要调解的就是这个参数。。。。。默认的参数现实上是从100到1000，，这个你得自己改，，若是你希望产品的巨细切合你的预期，，尽可能把规模改。。。。。帽480-500，，详细看情形调解。。。。。第二个参数是“Primer Size”，，默认值一样平常可以用，，可是，，当你用熟了这个软件，，你自己就知道该怎么改了。。。。。第三个参数是”Primer Tm”这个和Primer Size差未几。。。。。

第四步：Pick primers： 点一下这个按钮，，切合你巨细预期的primer就出来了，，看看Primer3 Output的界面，，何等漂亮！你要的primer出来了，，并且有primer在序列上的位置比对图，，还要primer自己的信息，，包括位置，，长度，，Tm，，GC含量，，任何位置互补碱基数，，3'端互补碱基数，，以及引物序列，，（注重，，下游引物是5'->3'），，还要产品大。。。。。揭锛漤б饣ゲ辜罨揭锛3'端互补碱基数等。。。。。若是引物尚在参数设定的规模内，，但还不是最佳，，将会给出忠言。。。。。

第五步：引物设计磨练：可以仅仅设计一直引物，，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。。。。。也可以自己界说引物，，放在Primer框里，，（注重，，下游引物的誊写反向仍然是5'->3'）若是切合设定的条件，，软件将对给出引物评分，，同时给出忠言信息，，凭证忠言信息可以适当对自界说引物做些调解即可，，忠言信息也让你做实验的时间胸有定见。。。。。关于文献揭晓的引物，，最好都要检查一下，，这样就可以阻止被别人有意无意误导。。。。。至于RT-PCR所用的引物，，最好是使得产品跨过内含子，，这样阻止潜在DNA对RT-PCR的滋扰。。。。。现实做引物的时间，，要把内含子都去掉，，仅仅把外显子序列放入源序列框中，，并且通过自界说引物设计的要领，，使上下游引物划分所有或者部分落在差别外显子上。。。。。至于怎样快速识别内含子和外显子以及电子PCR，，我将抽闲另做说明。。。。。

至于设计出来的引物的现实效果，，凭证我的履历，，一样平常情形下都能做到PCR一次乐成，，也许随便那一段序列做引物也能抵达很好的效果，，可是不管怎么说，，软件做引物可以让自己胸有定见。。。。。最后，，GOOD LUCK TO EVERYONE.