RT-PCR Kit（逆转录试剂盒）

产品说明

RT-PCR Kit(逆转录试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的、具有高迅速度的RT-PCR反应系统。
。该系统合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的种种组分，，，，，优化的系统包管了M-MLV具有高效的逆转录酶活性，，，，，所得cDNA对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，，，，，可用于检测有数基因的表达、从少少数细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片断等。
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M-MLV逆转录酶是由一个71 kD的单亚基组成的重组型DNA逆转录聚合酶。
？？？梢源呋RNA或DNA：RNA杂交链为模板的互补DNA 的聚合反应。
。本酶经修饰RNase H活性比通俗的逆转录酶要弱许多，，，，，因此在合成第一链cDNA的历程中，，，，，可包管RNA的降解水平较低，，，，，从而使得率提高。
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产品组分

R1011可举行20次逆转录反应,R1012可举行100次逆转录反应（20 μl 标准PCR反应系统，，，，，每次使用 M-MLV 1μl）。
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M-MLV 贮存液

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

200 mM NaCl

0.1 mM EDTA

1 mM DTT

0.01% NP-40

50% glycerol

5xfirst-strand buffer 因素

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)

375 mM KCl

15 mM MgCl2

50 mM DTT

质量检测

逆转录酶活性检测

使用[32P]dCTP作为标记，，，，，200 U的 M-MLV以1μg、1.2 kb的RNA为模板进逆转录反应，，，，，最低可获得120ng的cDNA，，，，，所得cDNA长度 > 全长的90%。
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核酸外切酶活性检测

混淆50ng的标记DNA 或RNA与200U M-MLV在1×反应缓冲液系统中，，，，，37℃温浴1 h，，，，，检测DNA和RNA降解都不到总量的1%。
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适用规模

第一链cDNA 合成

cDNA文库构建

RT-PCR

引物延伸

3'和5' RACE

注重事项

l  乐成的cDNA合成来自高质量的RNA。
。高质量的RNA至少应包管全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂，，，，，如EDTA或 SDS。
。用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC举行处置惩罚，，，，，并在高压灭菌后使用。
。有些试剂不可用高压灭菌处置惩罚时，，，，，首先用经由灭菌的用具、水等配制溶液后，，，，，再将溶液举行过滤除菌处置惩罚。
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l  为了增添贮存RNA样品的稳固性，，，，，可以将RNA消融在去离子的甲酰胺中，，，，，存于-70℃。
。用于生涯 RNA 的甲酰胺一定不可含有降解RNA的杂物。
。泉源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中生涯一年。
。当准备使用RNA时，，，，，可以使用下列要领沉淀RNA：加入NaCl至0.2 M同时加入4倍体积的乙醇，，，，，室温安排3-5 min，，，，，10,000 rpm离心5 min。
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l  在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂（RNasin）以增添cDNA合成的长度和产量。
。在第一链合成反应中，，，，，RNase抑制剂在缓冲液和还原剂（如 DTT）保存的条件下加入，，，，，由于cDNA合成前的历程会使抑制剂变性，，，，，从而释放出RNase。
。可是RNase抑制剂仅避免RNase A，，，，，B，，，，，C 对RNA的降解，，，，，并不可避免皮肤上的RNase，，，，，因此只管使用了RNase抑制剂，，，，，也要小心不要从手指上引入RNase。
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l  较高的保温温度有助于RNA二级结构的翻开，，，，，增添反应的产量。
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l  使用简朴的RNA纯化要领即可获得知足RT-PCR反应的RNA，，，，，但为了包管实验的乐成率，，，，，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。
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l  为避免RNA降解，，，，，应只管阻止重复冻融，，，，，最好生涯于-70℃。
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l  最佳的PCR反应条件，，，，，因PCR扩增仪的差别而差别，，，，，以是在使用您的样品之前最好先试做一下control反应，，，，，以确定最佳的PCR反应条件。
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l  cDNA产品应置于-20℃生涯。
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l  当以cDNA为模板举行PCR之前，，，，，使用RNase H处置惩罚cDNA，，，，，可以提高PCR反应的迅速度。
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操作办法

1 在冰浴的无菌离心管中配制下列混淆物

1-5μg RNA

1μl Oligo(dT)₁₅ 或Random primer，，，，，

补RNase-free ddH₂O至13.4μl；；；；；

2举行变性退火反应

70℃温浴5 min,

简短离心后冰浴5 min；；；；；

3在上述离心管中配制反转录反应液

4 μl  5×first-strand buffer

1 μl  dNTPs（10 mM each）

0.6μl  RNasin ,

1 μl   M-MLV；；；；；

4按下列条件举行反转录反应

Oligo (dT)₁₅ ：42℃温浴60 min；；；；；

Random primer： 37℃温浴60 min。
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5终止反应

70℃温浴5 min终止反应，，，，，置冰上举行后续实验或-20℃生涯。
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6用RNase-free ddH₂O将反应系统稀释到50μl，，，，，取2-5μl举行PCR扩增反应。
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